Genetisch bedingte Krankheiten / Therapie

CRISPR – ein mächtiges Tool zur genetischen Manipulation

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CRISPR bzw. CRISPR-Cas9 ist ein der Natur abgeschautes Werkzeug zur Manipulation von Erbgut. Es gewinnt breite Bedeutung in der Diagnostik (z. B. von Viruskrankheiten), der Therapie (z. B. von Krebs, Viruskrankheiten) und der Korrektur von pathologischen Erbanlagen.

CRISPR bedeutet „clustered regularly-interspaced short palindromic repreats“. Es handelt sich bei CRISPR um Segmente prokaryotischer RNA, welche kurze sich wiederholende Basensequenzen enthalten. Die genauere Bezeichnung ist CRISPR-Cas, wobei Cas „CRISPR assoziiertes System“ bedeutet. Mit Hilfe dieser Methode kann Erbgut relativ einfach verändert werden. Nach seiner Entdeckung steht es inzwischen als Werkzeug zur Modifikation von jedwedem Genom zur Verfügung und hat in Forschung und pharmazeutischer Industrie eine extrem hohe Bedeutung erlangt.

Das Wichtigste verständlich

Kurzgefasst
Biochemiker in Berkeley haben in Prokaryoten ein System entdeckt, das sie vor Viren schützt: CRISPR/Cas. Zwischen Bakterien und Phagen existiert seit Jahrmillionen ein “Krieg”, bei dem Phagen ihre Erbinformationen in Bakterien einschleusen und heimlich in deren Genom integrieren. Als Abwehrmechanismus haben Bakterien das CRISPR-System entwickelt, was extrem effektiv die integrierte DNA wieder heraus schneidet.

Das System ist jetzt so gut bekannt, dass man es für die Forschung und therapeutische Anwendungen nutzen kann. Mit seiner Hilfe lässt sich jedes beliebige Schnipsel quasi fehlerfrei speichern und ohne großen Aufwand aus jedem DNA-Strang entfernen. Die CRISPR/Cas-Methode funktioniert auch am menschlichen Erbgut. Perspektiven sind die Heilung genetischer und einiger chronisch viraler Krankheiten. Chinesische Forscher haben mit Hilfe dieser Methode schon 2015 erfolgreich das Genom nicht überlebensfähiger menschlicher Embryonen verändert. Inzwischen lassen sich genetisch bedingte vererbbare (hereditäre) Krankheiten heilen. Ein Beispiel dafür ist das hereditäre Angioödem. (1)N Engl J Med. 2024 Feb 1;390(5):432-441. DOI: 10.1056/NEJMoa2309149

Eine segensreiche Anwendung ist in der Onkologie zu sehen. Mit CRICPR-Cas lassen sich Gene herausschneiden, die zu Krebs prädisponieren, beispielsweise Onkogene wie BRCA-1, das die Bereitschaft für Brustkrebs erhöht. Die Manipulation von überlebensfähigen Eizellen lässt fortpflanzungsfähige “mutierte” Lebewesen entstehen. Sie wurde bereits zur Standardmethode zur Generierung gentechnisch veränderter Tiermodelle, die in der Forschung eingesetzt werden. (2)Methods Mol Biol. 2020;2066:47-57 Auch in der menschlichen Präimplantationsmedizin spielt die Genscherenmethode eine zunhemende Rolle. (3)Mol Ther. 2023 Aug 2;31(8):2326-2341

Eine weitere Anwendung ist die Speicherung von beliebigen Informationen in bakterieller DNA. Faszinierende Beispiele zeigen die Speicherung von Bildern und sogar kleiner Filmsequenzen (siehe hier).

Ein Problem ist das mit der Methode aufgekommene Missbrauchspotential. Eine der Erfinderinnen schilderte 2015, wie sie das erlebt hat, und welche Implikationen sie sieht, in einem Nature-Artikel zur Entwicklung der CRISPR-Methode (4)Nature. 2015 Dec 24;528(7583):469-71. (Zum Bericht siehe hier).

Evolutionäre Bedeutung

CRSPR/Cas funktioniert als ein adaptives Immunsystem in Bakterien und Archaea. Um “Angreifer”, beispielsweise Viren, abwehren zu können, bedarf es eines Systems von Abwehrmechanismen, unter denen die Fähigkeit einer Erinnerung an vorangegangene Angriffe zur Beherrschung wiederkehrender Infektionen eine zentrale Bedeutung innehat. CRISPR-Cas besitzt die Fähigkeit, DNA-Sequenzen von Angreifern zwischen den sich wiederholenden Sequenzen des CRISPR-Arrays in Form von “Spacern” zu integrieren und so zu behalten. Mit deren Hilfe ist es einer Zelle möglich, über Cas-Nukleasen bei erneuter Infektion gezielt erneut eingedrungene DNA zu spalten (5)Mol Microbiol. 2014 Jul;93(1):1-9. doi: 10.1111/mmi.12640.. Dies hat einen entscheidenden evolutionären Überlebensvorteil für diejenigen Bakterien bedeutet, die solch ein Erinnerungs- und Abwehrsystem besitzen.

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Prinzip

CRISPR stellt ein mächtiges Werkzeug dar, mit dem das Erbgut von Lebewesen und Viren tief greifend manipuliert werden kann. Definierte DNA-Schnipsel können mit CRISP/Cas9 in DNA (als Spacer, s. o.) eingefügt und aus jedwedem Genom auch herausgeschnitten und entfernt werden. (6)Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(7):4336-43    (7)Plant Methods. 2016 Jan 28;12:8   (8)Viruses. 2016 Mar 7;8(3). pii: E72. doi: 10.3390/v8030072.   (9)Science. 2014 Nov 28;346(6213):1258096. doi: 10.1126/science.1258096. (10)J Gen Virol. 2015 Mar;96(Pt 3):626-36   (11)Genomics Proteomics Bioinformatics. 2015 Dec;13(6):336-44

Anwendungen

Die meisten Untersuchungen mit CRISPR finden an Pflanzen, Bakterien und Tiermodellen statt. Was die medizinische Forschung betrifft, so werden meist Tiermodelle eingesetzt. Hier einige Beispiele von Anwendungsgebieten, die die Bedeutung der Methode sichtbar machen:

Diabetes: Mit Hilfe der CRISPR-Technik wurden Leptin-knock-out-Mäuse hergestellt, die zur Diabetes-Forschung dienen sollen (12)Sci Rep. 2015 Nov 5;5:15942. doi: 10.1038/srep15942. Diese dienen seither als Versuchstiere für die Diabetes- und Adipositasforschung. (13)Front Microbiol. 2021 Sep 7;12:703929. doi: 10.3389/fmicb.2021.703929   (14)Front Endocrinol (Lausanne). 2021 Sep 27;12:698115. DOI: 10.3389/fendo.2021.698115

Neuropsychiatrische Krankheiten: Mit Hilfe der CRISPR-Technik wurden Affen genetisch so modifiziert, dass sie autistisches Verhalten zeigten. Die inokulierte Anlage ließ sich in den F1-Nachkommen ebenfalls nachweisen. (15)Nature. 2016 Feb 4;530(7588):98-102. DOI: 10.1038/nature16533 Die Überlegungen gehen dahin, das prädisponierende Gens (MECP2) aus dem Genom zu entfernen, was dazu führen soll, dass Risiko zu autistischem Verhalten zu reduzieren (16)Nature. 2016 Jan 28;529(7587):449. doi: 10.1038/529449a. Auch andere neurologische Krankheiten, wie die Alzheimer-Demenz, der Morbus Huntington und der Morbus Parkinson, sind im Blick der neuropsychiatrischen Forschung. (17)Prog Mol Biol Transl Sci. 2021;178:231-264. DOI: 10.1016/bs.pmbts.2020.12.010.   (18)Cell. 2020 Apr 30;181(3):590-603.e16. DOI: 10.1016/j.cell.2020.03.024 .

Krebs: Die CRISPR/Cas-Methode hat das Verständnis der Krebsgenetik, des nichtkodierenden Genoms und der Tumorheterogenität wesentlich erweitert. Es werden auch auf diesem Gebiet weitere bahnbrechende Ergebnisse erwartet. (19)Nat Rev Cancer. 2022 May;22(5):259-279. DOI: 10.1038/s41568-022-00441-w Es lassen sich durch die CRISPR-Methode genetisch definierte Tumore herstellen, die als Krebsmodelle dienen können (20)Front Genet. 2016 Feb 29;7:28. doi: 10.3389/fgene.2016.00028.

Genetische Krankheiten: Es besteht die Erwartung, dass mit Hilfe der CRISPR-Technik genetisch bedingte Krankheiten, wie die Sichelzell-Anämie, die zystische Fibrose (CF) und die Duchenne-Muskeldystrophie einer Heilung zugeführt werden können. (21)Biologics. 2021 Aug 21;15:353-361. doi: 10.2147/BTT.S326422

Anwendung bei Pflanzen: Große und bedeutende Anwendungsgebiete der CRISPR/Cas-Technik sind die Herstellung gentechnisch veränderter Heilpflanzen zur Produktion von Pharmazeutika und die Herstellung resistenter und ertragreicher Nahrungspflanzen. (22)Pharmacol Res. 2021 Feb;164:105359. doi: 10.1016/j.phrs.2020.105359 Die Perspektiven sind bezüglich der Welternährung bedeutend. (23)Plants (Basel). 2022 Apr 12;11(8):1052. DOI: 10.3390/plants11081052.   (24)DOI: 10.1007/s11033-022-07523-w

Veränderung des Erbguts bei erblichen Defekten. Frühe Beispiele

Eine Anwendung in der Medizin, z. B. zur Bereinigung des menschlichen Genoms eines bestimmten belasteten Menschen von Krankheitsgenen, z. B. von Onkogenen, bietet sich an. Denn auch das menschliche Erbgut lässt sich mit der CRISPR-Technik manipulieren (25)Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Dec 22; 112(51): E7110–E7117   (26)Genome Biol. 2013 Feb 26;14(2):107. doi: 10.1186/gb-2013-14-2-107.  Männliche Infertilität und Erbkrankheiten können perspektivisch geheilt werden (27)Fertil Steril. 2016 Feb;105(2):256-66   (28)Kang X et al. J Assist Reprod Genet. 2016 Apr 6. [Epub ahead of print]. Untersuchungen einer chinesischen Gruppe zur Manipulation am ß-Globin-Gen an menschlichen Präimplantationsembryonen (nicht lebensfähige Embryonen im 3PN-Stadium) verliefen vielversprechend (29)Protein Cell. 2015 May;6(5):363-72. Eine andere chinesische Gruppe zeigte, dass menschliche pluripotente Stammzellen von einem tauben Patienten durch Korrektur von iPSCs (CP-iPSCs) genetisch geheilt werden konnten, wobei sie ihre Pluripotenz behielten (30)Stem Cells Transl Med. 2016 Mar 24. pii: sctm.2015-0252.. Die durch Mutation des LDL-Rezeptors bedingte Hypercholesterinämie und Arteriosklerose lässt sich im Mausmodell durch Korrektur der Punktmutation im Ldlr-Gen in Hepatozyten deutlich bessern; die Blutspiegel des Gesamtcholesterins, des LDL-Cholesterins und der Triglyceride sanken, und in der Aorta verkleinerten sich die atherosklerotische Plaques. (31)Circulation. 2020 Jan 7;141(1):67-79. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.042476.

T-Lymphozyten und Krebsbekämpfung

Die Funktion der körpereigenen Immunzellen (T-Lymphozyten) lässt sich mit Hilfe von CRISPR-Cas9 so verändern, dass auch Tumorzellen ganz spezifisch angegriffen werden können. Eine Forschergruppe ersetzte das Gen für den endogenen T-Zell-Rezeptor durch einen neuen, der gegen ein Oberflächenantigen von Krebszellen gerichtet war. Die veränderten T-Zellen erkannten daraufhin die speziellen Krebszellen in vitro und in vivo. Diese Methode steht 2018 vor klinischen Tests. Ziel ist es, das eigene Immunsystem zur Krebsbekämpfung zu mobilisieren. (32)Nature. 2018 Jul 11. doi: 10.1038/s41586-018-0326-5. DOI: 10.1038/s41586-018-0326-5

Eine Science-Arbeit beschreibt ebenfalls, dass Immunzellen (T-Lymphozyten) so verändert werden können, dass sie Krebszellen besser bekämpfen. Eine der eingeführten Veränderungen förderte den programmierten Zelltod (Apoptose) der Krebszellen. Es wurde gezeigt, dass diese neu programmierten T-Lymphozyten nach Transplantation in drei Krebspatienten über 9 Monate überleben. Sie wurden also vom Immunsystem der Patienten toleriert und kommen daher laut den Autoren zur Krebstherapie in Betracht. (33)Science. 2020;367(6481):eaba7365. doi:10.1126/science.aba7365 … Continue reading

T-Lymphozyten können auf individuelle Tumore ausgerichtet werden. Solche chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen stellen einen Durchbruch in der personalisierten Krebstherapie dar. Dabei werden synthetische Rezeptoren, die aus Antigenerkennungs-, Signalisierungs- und costimulatorischen Domänen bestehen, dazu verwendet, um T-Zellen neu zu programmieren. Sie zeigen gegen B-Zell-Lymphome eine hohe Responsrate. (34)N Engl J Med. 2018;378:449–459 DOI: 10.1056/NEJMoa1709919   (35)J Hematol Oncol. 2020 Sep 7;13(1):122. DOI: 10.1186/s13045-020-00953-8

HIV-Therapie

Die CRISPR-Cas-Technik eröffnet neue Möglichkeiten einer HIV-Therapie mit Heilungsperspektive. Angestrebt wird die Exzision von Segmenten integrierter proviraler DNA aus latent infizierten Zellen und die vollständige Eliminierung von Proviren. (36) 2017 Oct-Dec;19(3):167-172.   (37) 2016 Mar 4;6:22555. doi: 10.1038/srep22555. Insbesondere die HIV-1-regulatorischen Gene scheinen ein geeignetes Ziel zu sein. (38) 2018 May 17;8(1):7784. doi: 10.1038/s41598-018-26190-1.

Es wurde gezeigt, dass die Genschere CRISPR-Cas13 zur Therapie von RNA-Virus-Infektionen genutzt werden kann, wie der lymphozytischen Virusmeningitis, der SARS-Cov-2-Infektion oder dem Dengue-Fieber. Jetzt wurde auch nachgewiesen, dass Cas13a die HIV-1-RNA-Expression in menschlichen Zellen wirksam unterbindet, und zwar schon beim Eindringen des Virus, und dass es infolgedessen die HIV-1-Infektion stark hemmt. Es entsteht eine neue wirksame Therapieoption. (39)Mol Ther Nucleic Acids. 2020;21:147-155. doi:10.1016/j.omtn.2020.05.030

Bakterielle DNA als Informationsspeicher

Inzwischen ist es mit Hilfe der CRISPR-Cas-Technik gelungen, beliebige Informationen in bakterielles Erbgut einzubauen. Damit erweist sich bakterielle DNA als potenzieller Informationsspeicher, der sogar von Generation zu Generation weitgehend fehlerfrei weitergegeben wird. Spektakuläre Beispiele sind die Speicherung von Bildern und kleiner Videosequenzen (40)Nature. 2017 Jul 12. doi: 10.1038/nature23017 (zur Veröffentlichung mit der Videosequenz siehe hier).

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Ethische Debatte

Missbrauchspotenzial

Die Technik, mit der mit Hilfe von CRISPR Erbgut manipuliert werden kann, besitzt das Potenzial zu erheblichem Missbrauch. Sie kann sowohl im Agrarbereich als auch in der Medizin Umwälzungen herbeiführen, die sich nicht nur günstig und segensreich, sondern auch schädlich oder gar fatal auswirken, und deren Ingangsetzung nicht umkehrbar ist.

Es können neue Spezies geschaffen und wahrscheinlich ausgestorbene rekonstruiert werden. Was den Menschen betrifft, so wird man körperliche, geistige und psychische Eigenschaften verbessern oder an einen Bedarf anpassen können. Sciencefiction wird Realität.

Die dadurch entstehende ethische Problematik der Forschungsrichtung wird nur langsam realisiert. Während die öffentliche Diskussion dazu erst beginnt, werden bereits Untersuchungen in neue Richtungen hinein durchgeführt. Auch wenn jede einzelne Untersuchung ethisch unproblematisch sein wäre, so kann ihr Ergebnis im Zusammenhang mit Fortschritten an anderen Fronten dazu führen, dass auch ethisch nicht verantwortbare Entwicklungsrichtungen möglich und eingeschlagen werden.

Die neue Technik birgt hohe Sprengkraft. Weder einzelne Forscher noch Ethiker können mit der zunehmenden Geschwindigkeit der Neuerungen Schritt halten. Die Frage, ob gemacht werden darf, was gemacht werden kann, stellt sich angesichts der Möglichkeiten der CRISPR-Technik elementar (41)Mil Med Res. 2015 Oct 15;2:25. doi: 10.1186/s40779-015-0054-1. Einzelnen Forschern wie auch Ländern, in denen die Forschung vorwärts getrieben wird, wird wurde früh ein Mangel an ethischem Bewusstsein vorgeworfen (42)Dev World Bioeth. 2016 Jan 21. doi: 10.1111/dewb.12108.. Der Wildwuchs bereitete Pionierforschern, denen die Sprengkraft der Methode bewusst geworden ist, schlaflose Nächte (43)Nature. 2015 Dec 24;528(7583):469-71.

Eine Aktualisierung der Debatte ist durch die Überlegungen zur Erhöhung menschlicher Fähigkeiten in militärischen Bereichen aufgekommen. Insbesondere geht es in einem Artikel um Anwendungen, um Servicepersonal gegen biologische und chemische Waffen zu schützen. (44) 2018 Jul 2. doi: 10.1007/s11673-018-9865-6.

2015: Moratorium für die CRISPR-Forschung?

Um mit der ethischen Aufarbeitung nachkommen zu können und inakzeptablen Fehlentwicklungen vorzubeugen, wurde 2015 ein Moratorium für die CRISPR-Forschung vorgeschlagen. Die UN warnt vor eugenischen Eingriffen in menschliche DNA (45)http://www.un.org/apps/news/story.asp?NewsID=52172. Die Diskussion um solch ein Moratorium wird innerhalb der an der CRISPR-Forschung beteiligten Wissenschaftler sehr kontrovers diskutiert. Ein klarer Standpunkt zu einem den Menschen direkt betreffenden Aspekt wurde in Nature unter der Überschrift „Don’t edit the human germ line“ veröffentlicht (46)Nature. 2015 Mar 26;519(7544):410-1.

Ein großes Problem besteht darin, dass sich Forscher bereits die Methode zur Manipulation von Genen in menschlichen Embryonen haben lizenzieren lassen (47)Nature. 2016 Feb 4;530(7588):18. doi: 10.1038/nature.2016.19270 und die Industrie die CRISPR-Technik längst in der Hand hat und die Forschung ohne Kontrolle durch die offene wissenschaftliche Welt weiter vorwärts treiben kann. Es wird spekuliert: „Where in the world could the first CRISPR baby be born?“ (48)http://www.nature.com/news/where-in-the-world-could-the-first-crispr-baby-be-born-1.18542 Als akute Gefahr wird erkannt, dass “Biohackers gear up for genome editing. Amateurs are ready and able to try the CRISPR technique for rewriting genes“ (49)http://www.nature.com/news/biohackers-gear-up-for-genome-editing-1.18236 . Viele Wissenschaftler sind der Meinung, dass unter dieser Perspektive die Freiheit der Forschung überdacht werden muss und ein Moratorium gerechtfertigt sei.

Es kamen früh erste Ideen zur Regulierung solch einer Forschung auf (50)Am J Bioeth. 2015;15(12):25-9. Sie sind allerdings erheblich umstritten. Es gibt starke Gegenstimmen durch Befürworter einer freien Forschung, die gegen eine Einschränkung der Forschung mit CRISPR an Stammzellen auftreten: „Banning human-germline editing could put a damper on the best medical research and instead drive the practice underground to black markets and uncontrolled medical tourism“ (51)Nature. 2015 Dec 3;528(7580):S7. doi: 10.1038/528S7a. Eine weitere Stimme schlägt vor: „Rather than a call to a generalized moratorium, or banning, of this type of research, efforts should be placed on establishing an open, international, collaborative and regulated research framework”. Die Autoren meinen, dass „Equally important, a societal discussion on the risks, benefits, and preferred applications of the new technology, including all relevant stakeholders, is urgently needed” (52)Vassena R et al. Hum Reprod Update. 2016 Feb 29. pii: dmw005. [Epub ahead of print].

Notwendigkeit einer öffentlichen Debatte

Die Öffentlichkeit und die Politik sollten nach Auffassung vieler Forscher ausführlich über das Potenzial und das Missbrauchspotenzial informiert und in die Debatte um die ethische Verantwortbarkeit der CRISPR-Forschung eingebunden werden (53)Vassena R et al. Hum Reprod Update. 2016 Feb 29. pii: dmw005. [Epub ahead of print] (54)Nature. 2015 Dec 24;528(7583):469-71.

Es werden zunehmend die zu behandelnden Fragen konkretisiert und zusammengestellt. Laut einer Veröffentlichung sollten folgende Punkte geregelt werden (55) 2018 Jun 7. pii: S0022-2836(18)30586-2. doi: 10.1016/j.jmb.2018.05.044.:

  1. das Ausmaß, in dem CRISPR verwendet werden sollte;
  2. der Zugang zu CRISPR-Anwendungen;
  3. ob der Rahmen für die klinische Forschung mit Menschen alle Formen der menschlichen Genombearbeitung, einschließlich der Bearbeitung der Keimbahn, berücksichtigt; 
  4. ob internationale Vorschriften, die unangemessene CRISPR-Nutzung regeln, erstellt und veröffentlicht werden sollten.

Jiankui He hat 2018 öffentlich gemacht, dass zwei weibliche Babys, „Lulu“ und „Nana“ geboren wurden, deren Keimbahn er durch die CRISPR-Cas9-Technologie verändert hatte. Damit hatte er entgegen der allgemeinen Meinung in der Community der Forschenden Tatsachen geschaffen. Sie führte zu erheblicher Unruhe und Versuche, einen ethischen Standard zu setzen und politische Grenzen zu ziehen. (56)Sci Eng Ethics. 2021 Jul 6;27(4):43. doi: 10.1007/s11948-021-00320-x   (57)Perspect Biol Med. 2020;63(1):44-53. DOI: 10.1353/pbm.2020.0003.

Das ethische Problem des Einsatzes von CRISPR-Cas9 an menschlichen Embryonen bleibt weiterhin hoch aktuell. Eine Publikation titelt: “Es bedarf einer gesellschaftsweiten Diskussion über die Bearbeitung des Keimbahngenoms mithilfe von CRISPR.” (58)Nat Med. 2024 Jan;30(1):30-32. DOI: 10.1038/s41591-023-02681-1

Verweise

 

Literatur[+]